空間代謝組學(xué)：?jiǎn)渭?xì)胞空間代謝流分析新方法
生物體內(nèi)的代謝物和脂質(zhì)不僅是細(xì)胞的關(guān)鍵組成模塊，它們?cè)谛盘?hào)傳導(dǎo)、表觀基因組調(diào)控、免疫、炎癥和癌癥發(fā)展中同樣具有重要作用和意義。代謝組學(xué)分析是我們了解、評(píng)估生物體、器官和細(xì)胞狀態(tài)的重要方式。而單細(xì)胞技術(shù)通過(guò)展示組織內(nèi)部甚至單克隆細(xì)胞之間的細(xì)胞異質(zhì)性，將生物學(xué)研究推進(jìn)至新維度。質(zhì)譜成像（MSI）技術(shù)可以從樣品中創(chuàng)建特定化合物的圖像，這些圖像是由樣品表面獲得的數(shù)千個(gè)質(zhì)譜生成的。每個(gè)記錄的質(zhì)譜都會(huì)為圖像貢獻(xiàn)***個(gè)像素，而每個(gè)質(zhì)譜中的峰都可以生成***個(gè)圖像。與其他成像方法相比，MSI無(wú)需化合物標(biāo)記，可實(shí)現(xiàn)非靶向分析。
本次與大***分享的是***篇***新發(fā)表于bioRxiv上的有關(guān)單細(xì)胞空間代謝流分析方法的文章[1]。 研究人員基于AP-SMALDI Orbitrap平臺(tái)開(kāi)發(fā)了***種命名為“13C-SpaceM”的新方法，通過(guò)13C標(biāo)記的葡萄糖示蹤葡萄糖依賴性脂肪酸從頭合成途徑（glucose-dependent de novo lipogenesis）。本方法應(yīng)用超高分辨率的基質(zhì)輔助激光解吸/電離實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞質(zhì)譜成像，并通過(guò)全離子碎裂模式（AIF）模擬了脂肪酸分析前處理過(guò)程中的皂化反應(yīng)，對(duì)包括甘油磷脂在內(nèi)的主要脂質(zhì)中的脂肪酸部分實(shí)現(xiàn)了共同分析。超高靈敏度、高分辨質(zhì)譜檢測(cè)器為單細(xì)胞內(nèi)脂肪酸同位素檢測(cè)提供了準(zhǔn)確的定性、定量結(jié)果。
研究人員通過(guò)鼠肝癌細(xì)胞的常氧-低氧模型，對(duì)檢測(cè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，確認(rèn)方法的有效性。之后應(yīng)用本方法分別檢測(cè)了ATP檸檬酸裂解酶基因敲降（ACLY knockdown）鼠肝癌細(xì)胞以及攜帶異檸檬酸脫氫酶（IDH）突變的小鼠膠質(zhì)瘤腦組織切片，通過(guò)比較脂肪酸的同位素豐度變化評(píng)估脂肪酸從頭合成比例以及外源性脂肪酸攝取的變化。分析結(jié)果揭示了在脂肪酸從頭合成過(guò)程中，乙酰輔酶A池（Acetyl-CoA pool）中存在大量的空間異質(zhì)性，這表明在微環(huán)境適應(yīng)過(guò)程中發(fā)生了代謝重編程。 01 研究背景 大氣壓MALDI成像分析是通過(guò)AP-SMALDI5離子源配合Q Exactive plus高分辨質(zhì)譜儀實(shí)現(xiàn)的。激光像素設(shè)置為 10×10 μm，激光衰減器角度設(shè)置為33°。質(zhì)譜在負(fù)離子模式下采用******全掃描和全離子碎裂（AIF）掃描模式。AIF模式的隔離范圍為 m/z 600-1000，掃描范圍為m/z 100-400，分辨率 140k，***大注入時(shí)間500 ms，碰撞能量NC 25%。（圖1） 圖1. 單細(xì)胞代謝流質(zhì)譜成像分析流程 （點(diǎn)擊查看大圖） MALDI分析前后，分別應(yīng)用顯微鏡檢測(cè)，確定細(xì)胞影像位置及MALDI消融標(biāo)記位置。通過(guò)檢測(cè)MALDI的消融標(biāo)記，將其與細(xì)胞影像疊加，并通過(guò)應(yīng)用數(shù)學(xué)公式進(jìn)行解卷積，從而整合顯微鏡圖像和MALDI圖像。實(shí)現(xiàn)了應(yīng)用MALDI成像質(zhì)譜檢測(cè)到的單細(xì)胞分子輪廓。（圖2） 圖2. 整合顯微鏡和MALDI-MS分析結(jié)果實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞質(zhì)譜成像（點(diǎn)擊查看大圖） 03 鼠肝癌細(xì)胞常氧-低氧模型單細(xì)胞成像分析 研究人員使用了兩種表達(dá)不重疊的shRNA序列（ACLYkd oligo1和ACLYkd oligo 2）細(xì)胞系以及***個(gè)對(duì)照組細(xì)胞系。通過(guò)使用1 μg/mL的四環(huán)素處理細(xì)胞72小時(shí)實(shí)現(xiàn)了ACLY沉默。 質(zhì)譜成像數(shù)據(jù)是以10 μm的像素大小獲得的，每個(gè)細(xì)胞的平均面積為550μm2，平均每個(gè)細(xì)胞有12個(gè)像素。通過(guò)應(yīng)用二項(xiàng)式模型計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的acetyl-CoA池標(biāo)記程度p值，從而量化細(xì)胞質(zhì)中acetyl-CoA池中從葡萄糖衍生的同位素標(biāo)記acetyl-CoA的比例。測(cè)試結(jié)果與預(yù)期相符，ACLYkd細(xì)胞中的acetyl-CoA池標(biāo)記水平低于對(duì)照組。值得注意的是，兩種ACLYkd細(xì)胞之間的差異非常明顯。ACLYkd oligo1的結(jié)果呈雙峰分布，p值的差異明顯較大，表明該細(xì)胞系存在兩個(gè)亞群體。其中***個(gè)模式顯示的p值與對(duì)照組相近，說(shuō)明存在***個(gè)“沉默失敗”的細(xì)胞亞群。ACLYkd oligo1第二個(gè)模式具有的p值明顯則低于ACLYkd oligo 2，表明ACLYkd oligo 1中還存在***個(gè)“強(qiáng)沉默”的亞群，在這些細(xì)胞中，沉默效率非常高，導(dǎo)致acetyl-CoA同位素標(biāo)記比例大幅降低。在ACLYkd oligo 2中，acetyl-CoA池的標(biāo)記程度以及GFP報(bào)告基因強(qiáng)度顯示出更均***的分布。M+2峰是***能表現(xiàn)出ACLYkd oligo1細(xì)胞中“強(qiáng)沉默”群體的低acetyl-CoA標(biāo)記表型的質(zhì)譜峰。M+8峰則為對(duì)照組細(xì)胞的特征標(biāo)記峰。M+2和M+8之間的差異可以作為顯示異質(zhì)性的指標(biāo)，用于展示葡萄糖對(duì)細(xì)胞質(zhì)中acetyl-CoA的相對(duì)貢獻(xiàn)。因此，13C-SpaceM能夠檢測(cè)ACLY敲降細(xì)胞中的異質(zhì)性，并識(shí)別不同的亞群體。這種單細(xì)胞和空間異質(zhì)性無(wú)法通過(guò)整體分析揭示，顯示了13C-SpaceM方法的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。 圖6. 細(xì)胞ACLY敲降后acetyl-CoA的同位素標(biāo)記程度分析（點(diǎn)擊查看大圖） 05 腫瘤組學(xué)中氨基酸合成異質(zhì)性的空間組學(xué)分析 研究人員分析了從橫向植入表達(dá)突變型異檸檬酸脫氫酶（IDH）和紅色熒光蛋白（RFP）的GL261膠質(zhì)瘤細(xì)胞的小鼠大腦組織切片。在采集組織前的48小時(shí)，小鼠被喂食未標(biāo)記的或含有U-13C葡萄糖的液體飲食。 ***先，研究人員分析了12C-葡萄糖飲食的腫瘤攜帶小鼠大腦切片中的酯化脂肪酸組成。通過(guò)比較質(zhì)譜TIC與顯微鏡明場(chǎng)和熒光成像，發(fā)現(xiàn)整個(gè)大腦（包括腫瘤區(qū)域）的質(zhì)譜離子響應(yīng)很高（圖7a）。測(cè)試過(guò)程中，腫瘤區(qū)域與組織切片的其余部分分別采用10μm和50μm激光分辨率進(jìn)行分析。對(duì)不同脂肪酸的空間分析揭示了在非腫瘤攜帶的腦半球組織中，脂肪酸豐度存在高度的異質(zhì)性，我們可以僅根據(jù)它們的脂肪酸組成來(lái)識(shí)別的某些結(jié)構(gòu)，如胼胝體和前連合部，這兩個(gè)區(qū)域都富含油酸（18:1）且棕櫚酸（16:0）、硬脂酸（18:0）和花生四烯酸（20:4）的含量低。有趣的是，盡管棕櫚酸、油酸、硬脂酸和花生四烯酸在腫瘤和周圍的大腦組織中的含量相似，肉豆蔻酸（14:0）和棕櫚酸（16:1）在腫瘤組織中則明顯增加。與大腦其它部分相比，腫瘤中必需脂肪酸亞麻油酸（18:2）和α/γ亞麻酸（18:3）也明顯增高。 之后，研究人員分析了喂食含有U-13C葡萄糖飲食的小鼠腫瘤組織，從腫瘤組織中選擇性分離出的5種主要從頭合成的脂肪酸的同位素分布（圖7c）。三種飽和脂肪酸肉豆蔻酸（14:0）、棕櫚酸（16:0）和硬脂酸（18:0）的13C攝入豐度較高，同位素分布***大分別可至M+10，M+12和M+14。其中，肉豆蔻酸M+0的強(qiáng)度極低，幾乎完全源自脂肪酸從頭合成。由于肉豆蔻酸對(duì)***些重要信號(hào)蛋白的翻譯后修飾很重要，這***發(fā)現(xiàn)表明膠質(zhì)瘤可能選擇性地上調(diào)肉豆蔻酸的合成以促進(jìn)自身生長(zhǎng)。相比之下，兩種單不飽和脂肪酸，棕櫚酸（16:1）和油酸（18:1）的M+0同位素的相對(duì)豐度較高。硬脂酸和油酸的M+2同位素豐度明顯增加，表明它們是由未標(biāo)記的前體（即棕櫚酸和棕櫚酸）延長(zhǎng)形成的。研究人員進(jìn)***步利用棕櫚酸的同位素分布計(jì)算acetyl-CoA池中源自葡萄糖的比例，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織內(nèi)的該比例同樣具有顯著的空間異質(zhì)性（圖7d）。 圖7. 小鼠腦膠質(zhì)瘤組織內(nèi)部脂肪酸代謝空間異質(zhì)性分析 總結(jié)
本文作者開(kāi)發(fā)了***種全新的單細(xì)胞代謝流成像檢測(cè)方法，將超高激光分辨率的大氣壓MALDI與高分辨率、高靈敏度的質(zhì)譜檢測(cè)器相結(jié)合，對(duì)細(xì)胞和腫瘤組織內(nèi)的葡萄糖依賴性脂肪酸從頭合成途徑實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞層面的空間分析。不僅為單細(xì)胞水平空間探測(cè)代謝活動(dòng)提供了新的方法，還為正常和癌癥組織中的脂肪酸攝取、合成和修飾分析提供了前所未有的視角。
(文章來(lái)源于儀器網(wǎng))
